วันอังคารที่ 8 มีนาคม พ.ศ. 2554

เค้าโครงงานวิจัย

1.  ชื่อเรื่อง :          การคัดเลือกราเอนโดไฟท์ที่มีฤทธิ์ยับยั้งจุลินทรีย์ก่อโรคจากป่าพรุควนเคร็ง

2.  ผู้รับผิดชอบ : นางสาวจำเนียร  กิ้วเส้ง

3. ความเป็นมาและความสำคัญ
ในปัจจุบันได้มีการนำเอาพืชมาใช้ประโยชน์ในการรักษาโรคต่าง ๆ   เนื่องจากพืชมีความสำคัญต่อชีวิตมนุษย์ รวมทั้งให้การสนับสนุนการใช้ประโยชน์จากสมุนไพร ซึ่งธุรกิจยาสมุนไพร และผลิตภัณฑ์สินค้าอุปโภคบริโภคที่มีส่วนผสมของสมุนไพรมีความจำเป็น  ซึ่งสมุนไพรเหล่านี้มีการกระจายพันธุ์อยู่ตามธรรมชาติอย่างหลากหลายโดยเฉพาะในประเทศทางเอเชีย ดังนั้น การวิจัยและพัฒนาพืชสมุนไพรเพื่อเป็นประโยชน์ในเชิงการแพทย์จำเป็นต้องคำนึงถึงปัจจัยหลายประการ ได้แก่ การคัดเลือกหาพืชที่มีคุณสมบัติของสารออกฤทธิ์ชนิดต่าง  ๆ การทดสอบหาองค์ประกอบทางเคมีของสารออกฤทธิ์  รวมทั้งความปลอดภัยในการนำสมุนไพรมาใช้เป็นอาหารและยารักษาโรค  จึงทำการจำแนกความหลากหลายและความจำเพาะของชนิดของสารออกฤทธิ์ในพืชแต่ละสายพันธุ์และทำการวิเคราะห์หาคุณสมบัติเชิงชีวภาพของสารออกฤทธิ์ในพืช  และคัดเลือกสายพันธุ์ที่มีการสร้างสารออกฤทธิ์ยับยั้งจุลินทรีย์ก่อโรคได้
ราเอนโดไฟท์เป็นราประเภทหนึ่งที่อาศัยอยู่ในเนื้อเยื่อส่วนต่าง ๆ ของพืชเกือบทุกชนิด โดยอาศัยแบบพึ่งพาและไม่ก่อให้เกิดโรคแก่พืชที่อาศัย  ซึ่งทำหน้าที่เป็นแหล่งอาหารให้กับเชื้อรา ซึ่งจากงานวิจัยที่ผ่านมาพบว่าราเอนโดไฟท์เป็นแหล่งสำคัญแหล่งหนึ่งที่สร้างสารทุติยภูมิที่มีฤทธิ์ทางชีวภาพและสามารถนำมาใช้เป็นยารักษาโรคได้ และเนื่องจากในปัจจุบันการใช้ยารักษาโรคกำลังประสบปัญหาการดื้อยา ทำให้นักวิทยาศาสตร์ต้องค้นหาตัวยาใหม่ๆ ในการรักษาโรค ซึ่งในปัจจุบันอาจมีการปรับเปลี่ยนโครงสร้างทางเคมีในตัวยาเดิมให้มีฤทธิ์ที่ดีขึ้น หรือการหาตัวยาใหม่ๆ จากแหล่งธรรมชาติต่างๆ โดยที่เชื้อราเป็นแหล่งจุลชีพแหล่งหนึ่งที่ได้รับความสนใจอย่างมาก (ขนิษฐา  พุดหอม)  มีรายงานการศึกษาพบว่าการแยกสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพโดยเฉพาะสารที่มีฤทธิ์ยับยั้งเซลล์มะเร็งและเชื้อแบคทีเรียก่อโรคชนิดดื้อยาจากราเอนโดไฟต์ที่แยกได้จากพืชสมุนไพรไทยและพืชป่าชายเลน โดยเฉพาะราเอนโดไฟต์ที่แยกได้จากพืชป่าชายเลนของไทยมีความน่าสนใจมาก เนื่องจากราเหล่านี้มักผลิตสารที่มีโครงสร้างที่น่าสนใจและมีฤทธิ์ทางชีวภาพที่ดี ซึ่งอาจเป็นเพราะพื้นที่ป่าชายเลนมีความผันแปรมากทางกายภาพและชีวภาพสูง ซึ่งสารเหล่านี้อาจนำไปพัฒนาเป็นยาที่ใช้ได้จริงในอนาคต
พรุควนเคร็งเป็นพื้นที่ที่มีขนาดใหญ่  มีเนื้อที่ประมาณ  195,545  ไร่  มีขนาดใหญ่เป็นอันดับ  2  รองจากพรุโต๊ะแดง  พรุควนเคร็งมีอาณาเขตติดอยู่ในพื้นที่  3  จังหวัด  คือจังหวัดนครศรีธรรมราช  จังหวัดพัทลุง  และจังหวัดสงขลา  (อาแว  และคณะ, 2546)  โดยมี ต.เคร็ง          .นครศรีธรรมราชเป็นจุดศูนย์กลางของป่าพรุ  บริเวณดังกล่าวเคยเป็นป่าดิบชื้นที่อุดมสมบูรณ์    มาก่อน  (สมบูรณ์  และคณะ,  2545)  แต่ในปัจจุบันพบว่าความอุดมสมบูรณ์ของระบบนิเวศป่าพรุลดลงเป็นอย่างมาก  (ปิติวงษ์ และคณะ, 2547)  ดินและน้ำบริเวณดังกล่าวมีค่าความเป็นกรดสูง       มีค่า pH  อยู่ระหว่าง  4-5  อันเป็นผลสืบเนื่องมาจากปัญหาไฟไหม้ป่าและการท่วมขังของน้ำในป่าพรุเป็นเวลานาน  (สมบูรณ์ และคณะ 2545;  อาแว และคณะ, 2546;  และปิติวงษ์  และคณะ,  2547)
        ดังนั้นการศึกษาราเอนโดไฟท์ในพืชจึงเป็นเรื่องที่น่าสนใจเป็นอย่างยิ่ง เนื่องจากเป็นอีกทางเลือกหนึ่งในการค้นหาราที่เป็นประโยชน์ ซึ่งในการศึกษาครั้งนี้ผู้วิจัยมุ่งศึกษาราเอนโดไฟท์จากพืชที่พบมากในป่าพรุควนเคร็ง  8  ชนิด  คือ  เสม็ด  เสม็ดขาว  หว้า  โทะ  โคลงเคลง  เม่า  กระจูดและธูปฤาษี  ที่มีคุณสมบัติในการสร้างสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพในการยับยั้งเชื้อจุลินทรีย์   ก่อโรค  ตลอดจนการจำแนกประเภทของราเอนโดไฟท์ที่มีฤทธิ์ทางชีวภาพด้วยวิธีทางสัณฐานวิทยา ซึ่งอาจจะนำไปใช้ประโยชน์ทางการแพทย์ อุตสาหกรรม และการเกษตรเพื่อนำไปสู่การทำการเกษตรแบบยั่งยืนซึ่งจะส่งผลให้เกษตรกรและผู้บริโภคมีคุณภาพชีวิตที่ดียิ่งขึ้น

4.              เอกสารและงานวิจัยที่เกี่ยวข้อง
ชัยวัฒน์  บุญมากาศ  และคณะ,  (2550)  ได้ทำการศึกษาศักยภาพในการผลิตสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพจากราเอนโดไฟท์ที่อาศัยอยู่ในพืชวงศ์  stemonaceae (หนอนตายหยาก)  ในการยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อแบคทีเรียก่อโรค  คือ  Erwinia  carotovora,  Pseudomonas  solanacearum subvar.1,   Pseudomonas  solanacearum subvar.2 และ  Xanthomonas  citrii  พบว่า  ราเอนโดไฟท์บางไอโซเลตสามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อแบคทีเรียได้ทั้ง  4  สายพันธุ์
ปิยะวดี เจริญวัฒนา, (2550)  สารสกัดที่หยาบจากใบพลู ( Piper betle L.) ละลายใน          ตัวทำละลาย 4 ชนิด คือ อาซิโตน ไดคลอโรมีเทน เอทิลอาซิเตท และเมทานอล นำมาทดสอบประสิทธิภาพในการยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อรา Aspergillus flavus A 748 ซึ่งเป็นเชื้อราที่สามารถผลิตสารแอฟลาทอกซินและปนเปื้อนในผลิตผลเกษตรและวัตถุดิบต่างๆ โดยการทดสอบด้วยวิธี paper disc diffusion พบว่าสารสกัดหยาบจากใบพลูที่ได้จากตัวทำละลายทั้ง 4 ชนิดที่ความเข้มข้น 500,000 พีพีเอ็ม ยับยั้งการเจริญของเชื้อรา มีค่าของบริเวณการยับยั้งเท่ากับ 19.5 21.0 22.5 และ 12.5 มิลลิเมตร ตามลำดับ โดยอาซิโตน ไดคลอโรมีเทน และเอทิลอาซิเตท สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อรา A. flavus A748 ในระดับที่ใกล้เคียงกับการใช้สารเคมี ซึ่งอาจนำสารสกัดจากใบพลูไปใช้เพื่อทดแทนสารเคมีที่ใช้อยู่ในปัจจุบัน
 พูนลาภ ป้อมเป็ง และคณะ,  (2550)  การตรวจกรองเบื้องต้นด้วยวิธี dual-culture agar diffusion ถึงฤทธิ์ต้านจุลินทรีย์ Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans ของราเอนโดไฟต์ที่แยกจากตัวอย่างพืชสมุนไพร (กรวยป่า เพกา และกอมขม) ซึ่งได้ทำให้พื้นผิวปราศจากเชื้อ พบว่า จากราเอนโดไฟต์ที่มีสัณฐานวิทยาทางโคโลนีแตกต่างกัน จำนวน 40 ไอโซเลต ซึ่งเพาะเลี้ยงบนอาหารเพาะเชื้อที่แตกต่างกัน 6 ชนิด มีจำนวนถึง 15 ไอโซเลต (37.5 %) ที่มีฤทธิ์ต้านจุลินทรีย์ทดสอบบางชนิด ยกเว้น                   P. aeruginosa ราเอนโดไฟต์ส่วนใหญ่มีฤทธิ์ต้าน S. aureus พบว่าชนิดของอาหารเพาะเชื้อมีผลต่อราเอนโดไฟต์ทั้งในด้านการสร้างสารออกฤทธิ์และความแรงของสารออกฤทธิ์ ราเอนโดไฟต์ส่วนใหญ่ที่มีฤทธิ์ต้านจุลินทรีย์เป็นราที่เพาะเลี้ยงบน malt extract agar การเพาะเลี้ยงราเอนโดไฟต์ในสภาวะที่แตกต่างกันคือบนอาหารแข็งและในอาหารเหลวมีผลต่อฤทธิ์ต้านจุลินทรีย์ของราเอนโดไฟต์บางชนิดเช่นกัน
คงเดช สวาสดิ์พันธ์  และคณะ,  (2547)  ทำการสกัดใบพลูแห้งด้วยปิโตรเลียมอีเทอร์ และตามด้วยเอทานอลที่อุณหภูมิห้อง ได้สารสกัดหยาบด้วยปิโตรเลียมอีเทอร์ 3.58 % และสารสกัดหยาบด้วยเอทานอล 9.54 % พบว่าสารสกัดหยาบด้วยเอทานอลออกฤทธิ์ยับยั้งเชื้อราและเชื้อแบคทีเรียสูงกว่าสารสกัดหยาบด้วย ปิโตรเลียมอีเทอร์ ทำการแยกสารสกัดหยาบด้วยเอทานอลโดยวิธี Vacuum Liquid Chromatography (VLC) ตามด้วยการแยกสารให้บริสุทธิ์โดยใช้ column  chromatography ได้สารบริสุทธิ์ที่ออกฤทธิ์คือ hydroxychavicol (1) ซึ่งมีลักษณะเป็นของเหลวคล้ายน้ำมันไม่มีสียืนยันโครงสร้างของสารที่ได้โดย จุดเดือดและข้อมูลทาง IR และ 1H NMR จากการทดสอบการออกฤทธิ์โดยวิธี Disc Agar Diffusion พบว่าสาร hydroxychavicol ออกฤทธิ์ยับยั้งเชื้อรา Trichophyton mentagrophytes ได้ดีด้วยค่า Inhibition index 6.03 และออกฤทธิ์ยับยั้งเชื้อแบคทีเรีย Staphylococcus aureus  และ  Streptococcus sp. ด้วยค่า Inhibition index 4.00 และ 3.33 ตามลำดับ
ลินจง สุขลำภู และคณะ  ได้ศึกษาการสกัดเปลือกส้มโอพันธุ์ขาวใหญ่และทองดีด้วยตัวทำละลาย     เฮกเซน เอธิลอะซีเตทและเอทานอล 95 เปอร์เซ็นต์  พบว่า เปลือกส้มโอส่วนสีเขียว (flavedo) ให้สารสกัดหยาบมากกว่าส่วนสีขาว (albedo) และการสกัดด้วยตัวทำละลายเอทานอลจะให้ปริมาณของสารสกัดหยาบสูงสุด จากการทดสอบประสิทธิภาพของสารสกัดจากเปลือกส้มโอในการยับยั้งการเจริญของแบคทีเรียก่อโรคทางอาหาร 6 ชนิด คือ Bacillus cereus TISTR 5040, Bacillus subtilis TISTR 6633, Listeria monocytogenes DMST 17256, Staphylococcus aureus TISTR 118, Escherichia coli ATCC 25922 และ Salmonella Typhimurium DMST 0562 ด้วยวิธี disk diffusion พบว่าสารสกัดจากเปลือกสีขาวของส้มโอพันธุ์ทองดีที่สกัดด้วยเฮกเซนสามารถยับยั้ง การเจริญของเชื้อ B. cereus, B. subtilis, L. monocytogenes  และ S. aureus ได้ดี
ศรัญญา พรศักดา และคณะ, (2553)  ได้ศึกษาการยับยั้งแบคทีเรียก่อโรคที่พบบ่อยในอาหาร โดยใช้มะเขือพวงที่เก็บเกี่ยวจากแหล่งเดียวกัน นำไปตากแห้งและใช้สดมาสกัดในเอธานอล (95%) นาน 48 ชั่งโมง จากนั้นนาสารสกัดหยาบมาทดสอบการยับยั้งแบคทีเรีย 3 ชนิด คือ Escherichia coli, Staphylococcus aureus และ Salmonella typhimurium บนอาหาร เลี้ยงด้วยวิธี agar diffusion พบว่า มะเขือพวงที่สกัดจากตัวอย่างสดและแห้ง สามารถยับยั้งการเจริญของแบคทีเรียที่นามาทดสอบได้ใกล้เคียงกันทั้ง 3 ชนิด แต่สารสกัดหยาบจากมะเขือพวงแห้งมีประสิทธิภาพดีกว่า
นัยนา ต่างใจ และสุริยา ฤธาทิพย์, (2552) ได้ศึกษาการออกฤทธิ์ของสารสกัดหยาบด้วย    เอทานอลเข้มข้น 95% จากพืช 4 ชนิด ได้แก่ หมากนวล หมากเขียว คูน และตะแบก โดยนำมาทดสอบความสามารถในการยับยั้งเชื้อจุลินทรีย์ คือ Escherichia coli และ Staphylococcus aureus พบว่ามีเพียงสารสกัดจากหมากนวลที่สามารถยับยั้งเชื้อได้ คือ Staphylococcus aureus จึงนำมาทดสอบต่อ พบว่าสารสกัดหยาบจากหมากนวลที่ความเข้มข้น  2,500,  500  และ 250 ppm  ตามลำดับ
มารุต  ตั้งชุลีพร และคณะ, (2551)  ได้ทำการศึกษาประสิทธิภาพในการต้านเชื้อจุลินทรีย์ของสารสกัดใบชะมวงที่สกัดด้วยน้ำต่อเชื้อแบคทีเรีย 9 ชนิด  คือ Staphylococcus  aureus, Bacillus  cereus,  Bacillus  subtilis,  Escherichia coli, Salmonella  enteric  subspecies  enteric  enteritrdis,  Salmonella spp.,  Klebsiella  pueumoniae,  Pseudomonas  aeruginosa, และ  Proteus  mirabilis  และเชื้อยีสต์ก่อโรค  2  ชนิด  คือ  Cryptococcus  neoformans  และ  Candida  albicans  โดยใช้วิธี  disc  diffusion  พบว่าสารสกัดด้วยน้ำของใบชะมวงมีฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรีย  โดยมีฤทธิ์ยับยั้งแบคทีเรียแกรมบวกได้ดีกว่าแบคทีเรียแกรมลบ

5. วัตถุประสงค์ของโครงการวิจัย
1.             เพื่อแยกเชื้อ  และคัดเลือกราเอนโดไฟท์จากเสม็ด  เสม็ดขาว  หว้า  โทะ  โคลงเคลง  เม่า  กระจูด และธูปฤาษี 
2.             เพื่อทดสอบฤทธิ์ทางชีภาพของน้ำเลี้ยงเชื้อและสารสกัดหยาบจากเส้นใยรา

6. ทฤษฎี  สมมติฐาน  (ถ้ามี)  และกรอบแนวคิดของโครงการวิจัย
โรคติดเชื้อ เป็นโรคซึ่งเป็นผลจากการมีเชื้อจุลชีพก่อโรค อาทิ  ไวรัส แบคทีเรีย และเชื้อรา โดยเฉพาะโรคที่เกิดจากการดื้อยา  ทำให้ก่อปัญหาในการรักษาอย่างมากมาย  จึงมีความจำเป็นที่จะต้องแสวงหายาต้านจุลินทรีย์ชนิดใหม่ ๆ มาใช้แทนยาเดิมที่ใช้ในการรักษาแล้วเกิดความไม่ได้ผล
ราเอนโดไฟท์เป็นราที่อาศัยอยู่ในเนื้อเยื่อของพืชและสามารถเจริญเติบโตได้ดีโดยไม่ทำให้ให้เกิดโรคหรือการเปลี่ยนแปลงทางสรีรวิทยาที่ผิดปกติแก่พืชชนิดนั้นๆ จะพบราเอ็นโดไฟท์ได้ในพืชตระกูลต่างๆ มากมาย และได้มีการศึกษาเกี่ยวกับราเอนโดไฟท์ที่พบมากในพืช  โดยมีความสำคัญต่อพืชที่อาศัยอยู่ทั้งทางตรงและทางอ้อม เพิ่มความแข็งแรงและทนทานต่อสภาวะแวดล้อมที่ไม่เหมาะสม ความหลากหลายทางชีวภาพของพืชกลุ่มนี้ มีคุณสมบัติที่จะเป็นประโยชน์ต่อการผลิตยาปฏิชีวนะ   ดังนั้นจึงคัดเลือกพืช 8  ชนิดที่มีชีวิตรอดจากไฟไหม้ในป่าพรุควนเคร็ง  เพื่อศึกษาสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพและทดสอบฤทธิ์ต้านจุลินทรีย์ก่อโรคอีกด้วย

7. ขอบเขตของโครงการวิจัย
1.             แยกเชื้อราเอนโดไฟท์จากกิ่งตัวอย่างพืชหลักที่ขึ้นในป่าพรุควนเคร็ง  ต.เคร็ง               จ.นครศรีธรรมราช  จำนวน  8  ชนิด  คือ  เสม็ด  เสม็ดขาว  หว้า  โทะ  โคลงเคลง  เม่า  กระจูด  และธูปฤาษี
2.             ทดสอบฤทธิ์ทางชีวภาพของน้ำเลี้ยงเชื้อและสารสกัดหยาบจากเส้นใยรา  โดยทำการทดสอบฤทธิ์ต้านแบคทีเรีย  ยีสต์  และรา
3.             จำแนกชนิดของเชื้อราเอนโดไฟท์ที่มีฤทธิ์ทางชีวภาพโดยวิธีทางสัณฐานวิทยา

8. นิยามศัพท์ (keywords)   :  ราเอนโดไฟท์,  พรุควนเคร็ง,  เสม็ด,  เสม็ดขาว,  หว้า,  โคลงเคลง,  เม่า,  โทะ,  กระจูดและธูปฤาษี

9. ประโยชน์ที่คาดว่าจะได้รับ
                1.  ทราบฤทธิ์ต้านแบคทีเรีย  ฤทธิ์ต้านรา  ของสารสกัดราเอนโดไฟท์จากเสม็ด  เสม็ดขาว  หว้า  โทะ  โคลงเคลง  เม่า  กระจูดและธูปฤาษี
                2.  ทราบชนิดของราเอนโดไฟท์ที่ผลิตสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพ

10.  วิธีดำเนินการวิจัย
     1.  สถานที่ทำการศึกษาทดลอง
                ศูนย์วิทยาศาสตร์  มหาวิทยาลัยราชภัฏนครศรีธรรมราช
   
     2.  วิธีการดำเนินการ
           2.1  การเก็บตัวอย่างพืช
                ทำการเก็บตัวอย่างพืช  8  ชนิด  คือ  เสม็ด  เสม็ดขาว  หว้า  โทะ  โคลงเตลง  เม่า  กระจูดและธูปฤาษี  จากป่าพรุควนเคร็ง  ตำบลเคร็ง  อำเภอชะอวด  จังหวัดนครศรีธรรมราช  โดยเก็บตัวอย่างใบพืชเลี้ยงคู่  หรือใบพืชและลำต้นของพืชใบเลี้ยงเดี่ยว  ที่มีลักษณะสมบูรณ์  ไม่มีลักษณะอาการของโรค  นำตัวอย่างพืชกลับมาแยกเชื้อราเอนโดไฟท์ทันที
                2.2  การแยกเชื้อรา
                นำตัวอย่างพืชมาล้างด้วย  detergent  ผึ่งให้แห้งภายใต้  laminar  air  flow  เมื่อตัวอย่างพืชแห้งแล้วใช้มีดผ่าตัดจุ่ม  95%  ethanol  นำไปผ่านเปลวไฟ  นำตัวอย่างพืชที่ตัดเป็นชิ้น ๆ  มากำจัดเชื้อบริเวณผิวโดยแช่ใน  95%  ethanol  นาน  30  วินาที  หลังจากนั้นนำไปแช่ใน  5%  sodium  hypochlorite  นาน  5  นาที  แล้วนำไปแช่ใน  95%  ethanol  อีกครั้ง  นาน  30  วินาที  นำตัวอย่างมาล้างด้วยน้ำกลั่นที่ฆ่าเชื้อแล้ว  นาน  3-5  วินาที  แล้วจึงนำตัวอย่างพืชไปวางบนอาหาร  potato  dextrose  agar  (PDA)  ที่เติมยา  tetracycline  และ  ampicillin  ความเข้มข้น  50  mg/L  นำไป incubate  ที่อุณหภูมิ  25 องศาเซลเซียส  เป็นเวลา  3-5  วัน  สังเกตผลทุกวัน  เมื่อพบว่ามีการเจริญของเชื้อรางอกออกมาจากชิ้นส่วนตัวอย่างพืช  ทำการตัดส่วน  hyphal  tip  ของเชื้อราแล้วนำไปเพาะเลี้ยงบนอาหาร  PDA  ที่ไม่เติมยาปฏิชีวนะ  โดยทำการเก็บตัวอย่างเชื้อราเป็นเวลา  7  วัน  เมื่อแยกเชื้อราได้บริสุทธิ์แล้ว  ทำการเก็บเชื้อราอาหารวุ้นเอียง  PDA เพื่อนำไปทดสอบต่อไป

                2.3  การเพาะเลี้ยงเชื้อราเอนโดไฟท์ในอาหารเหลวเพื่อใช้ทดสอบฤทธิ์ต้านจุลินทรีย์
               คัดเลือกเชื้อราเอนโดไฟท์ที่แยกได้  ซึ่งมีลักษณะของโคโลนีที่แตกต่างกัน   มาเพาะเลี้ยงในอาหาร PDA ที่ อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส นาน 3-4 วัน หรือจนกว่าจะพบว่ามีการเจริญของ colony ของเชื้อรา ใช้ใบมีดผ่าตัดจุ่ม 95% ethanol นำไปผ่านเปลวไฟ แล้วรอให้เย็น หลังจากนั้นนำไปตัดชิ้นส่วนบริเวณขอบของ colony ให้มีขนาดชิ้นละ 1×1 ตารางเซนติเมตร จำนวน 5 ชิ้น แล้วทำการถ่ายเชื้อลงในอาหารเหลว potato  dextrose broth (PDB) ปริมาตร 300 ml  ที่บรรจุในขวดรูปชมพู่ (flask) ขนาด 500 ml  นำไป  incubate ที่อุณหภูมิห้อง เป็นเวลา 3 สัปดาห์  เมื่อครบกำหนด  ทำการเก็บตัวอย่างน้ำเลี้ยงเชื้อรา เพื่อนำไปทดสอบฤทธิ์ต้านจุลินทรีย์เบื้องต้น

                2.4  การสกัดน้ำเลี้ยงเชื้อราและเส้นใยราด้วยตัวทำละลายทางเคมี
นำน้ำเลี้ยงเชื้อราเอนโดไฟท์ที่สามารถยับยั้งจุลินทรีย์ได้จากการทดสอบเบื้องต้น ไปสกัดด้วยตัวทำละลายทางเคมี เพื่อหาสารต้านจุลินทรีย์ที่เชื้อราเอนโดไฟท์ชนิดนั้นๆ  สร้างขึ้น โดยการกรองเส้นใยของเชื้อราออก  โดยกรองผ่านกระดาษกรอง Whatman เบอร์ 1
        2.4.1  การสกัดน้ำเลี้ยงเชื้อราเอนโดไฟท์
              ทำการสกัดโดยใช้ ethyl acetate ( EtOAc, AR grade) โดยใช้อัตราส่วนน้ำเลี้ยงเชื้อราต่อ EtOAc เท่ากับ 2:1 ทำการสกัดทั้งหมด 2 ครั้ง แล้วนำ EtOAc ที่ได้จากการสกัดทั้งสองครั้ง             มารวมกันแล้วใส่สารกำจัดน้ำ (dehydrating agent) คือ sodium sulphate anhydrous ลงไป  หลังจากนั้นกรองแล้วนำสารละลายที่ได้ไปทำให้แห้งด้วยเครื่อง rotary evaporator  ที่ อุณหภูมิ 40 – 50           องศาเซลเซียส  จนได้สารสกัดหยาบจากน้ำเลี้ยงเชื้อราเอนโดไฟท์   (BE, Broth EtOAc)     แล้วจึงนำไปทดสอบฤทธิ์ต้านจุลินทรีย์
                    


  2.4.2  การสกัดเส้นใยเชื้อราเอนโดไฟท์
                   ทำการสกัดคล้ายกับการสกัดน้ำเลี้ยงเชื้อรา โดยนำเส้นใยของเชื้อราแช่ใน   methanol
( MeOH, commercial grade) เป็นเวลา 2 วัน นำสารละลาย MeOH ไปทำให้เข้มข้นโดยการระเหยตัวทำละลายบางส่วนออกไป จากนั้นเติมน้ำลงไป แล้วนำไปสกัดด้วย hexane (AR grade) ในอัตราส่วน 2:1 โดยทำการสกัดซ้ำ 2 ครั้ง แล้วนำ hexane ที่ได้จากการสกัดไปทำแห้ง หลังจากนั้นนำสารละลาย aqueous MeOH ที่ผ่านการสกัดด้วย hexane แล้ว นำไปสกัดต่อด้วย EtOAc ในอัตราส่วน  2:1 เช่นกัน โดยสกัดด้วย EtOAc 2  ครั้ง  ซึ่งจากการสกัดดังกล่าวจะได้สารสกัด 2 ส่วน คือ Cell hexane  (CH) และ Cell EtOAc   (CE ) ตามลำดับ นำสารสกัดที่ได้ไปทดสอบฤทธิ์ต้าน     จุลินทรีย์
                2.5  การทดสอบฤทธิ์ต้านจุลินทรีย์
                        2.5.1  ทดสอบฤทธิ์ต้านจุลินทรีย์เบื้องต้น  สำหรับน้ำเลี้ยงเชื้อรา  ด้วยวิธี  agar  well  diffusion  (Lorian, 1990)

ทดสอบฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรียและยีสต์
                เตรียม  inoculum  ด้วยการ  streak เชื้อแบคทีเรีย Staphylococcus  aureus ATCC29523, Methicillin resistant S. aureus (MRSA) SK1, Escherichia coli ATCC25922   และ Pseudomonas aeruginosa ATCC27853 บนอาหารเลี้ยงเชื้อ  Nutrient  Agar  (NA) และเชื้อยีสต์ Candida  albicans ATCC90028  แล Cryptococcus  neoformans ATCC90012 บนอาหาร Saburaund dextrose agar  (SDA) แล้วนำไป incubate ที่ 35 องศาเซลเซียส นาน 18-24 ชั่วโมง  ยกเว้นเชื้อยีสต์                        C. neoformans ATCC90012   incubate ที่อุณหภูมิห้องนาน 48 ชั่วโมง เขี่ยเชื้อ 3-5 โคโลนีเดี่ยว ๆ (single colony)  ลงในอาหารเลี้ยงเชื้อ NB สำหรับแบคทีเรีย และ Saburaund dextrose broth  (SDB) สำหรับเชื้อยีสต์  นำไป incubate ไว้ที่ 35 องศาเซลเซียส 3- 5 ชั่วโมง หลังจากนั้นนำมาปรับให้ได้ความขุ่น 0.5 และ 2.0 McFarland standard สำหรับแบคทีเรียและยีสต์ตามลำดับด้วย  normal  saline  solution  (NSS)  ทำการลงเชื้อโดยใช้ไม้พันสำลีที่ผ่านการฆ่าเชื้อ (sterile cotton swab) จุ่มเชื้อ แล้วบิดให้หมาดๆ ทำการ  swab  ให้ทั่ว plate อาหารที่มีความหนา 4 mm ซึ่งแบคทีเรียจะใช้อาหาร MHA และยีสต์ใช้ SDA หลังจากนั้นทำการเจาะวุ้นอาหารด้วยปลายที่จับของหลอดหยด (dropper) ขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 6 mm โดยทำทั้งหมด 17 หลุมต่อจาน หลังจากนั้นหยดน้ำเลี้ยงเชื้อของ  เชื้อราที่เพาะเลี้ยงใน PDB ที่อายุ 3 สัปดาห์ ปริมาตร 80 µl ลงในหลุมที่เจาะไว้ ในชุดควบคุมจะใช้แผ่นยาปฏิชีวนะมาตรฐานโดยการทดสอบกับแบคทีเรีย S. aurues ATCC29523  จะใช้ยา vancomycin 30 µg/แผ่น E. coil ATCC25922 และ P.  aeruginosa ATCC27853 ใช้ยา gentamycin 10 µg/แผ่น ส่วนยีสต์ใช้ amphotericin B 10 µg/ แผ่น นำไป incubate ที่ 35 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 18-24 ชั่วโมง   สำหรับเชื้อ   C.  neoformans  ATCC90012 นำไป incubate ที่อุณหภูมิห้องนาน      48 ชั่วโมง เมื่อครบกำหนดเวลาอ่านผลโดยการวัดเส้นผ่านศูนย์กลางของ inhibition zone โดยใช้ vernier caliper หน่วยการวัดเป็นมิลลิเมตร

การทดสอบฤทธิ์ต้านเชื้อรา  (ดัดแปลงจากวิธีของ Huang et al., 2000)
                เตรียม inoculum ของเชื้อรา โดยเลี้ยง M. gypseum บนอาหารเลี้ยงเชื้อ SDA นำไป incubate ที่ 25 องศาเซลเซียส 3-4 วัน ให้ได้ colony ที่มีลักษณะกลมขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางประมาณ 2 cm หลังจากนั้นใช้ ปลายที่จับของหลอดหยด (dropper) เจาะในอาหารที่อยู่รอบ colony ของเชื้อราที่กำลังเจริญเติบโต โดยเจาะห่างจากขอบของ colony ประมาณ 0.5 cm แล้วหยดน้ำเลี้ยงเชื้อราที่เพาะเลี้ยงในอาหารเหลว PDB ที่มีอายุ  3 สัปดาห์ ปริมาตร 80 µl ลงในหลุมที่เจาะไว้
ใช้ชุดทดสอบควบคุมยา miconazole nitrate ความเข้มข้น 30 mg/แผ่น นำไป incubate ที่อุณภูมิ                25 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 3- 4  วัน  สังเกตผลการยับยั้งเชื้อทุกวัน หากมีการยับยั้งจะพบ  inhibition  zoneหรือพบว่าเชื้อไม่สามารถเจริญเลยหลุมออกไปได้

                       2.5.2  การทดสอบฤทธิ์ต้านจุลินทรีย์  สำหรับสารสกัดหยาบจากเชื้อราเอนโดไฟท์  โดยวิธี  agar  disc  diffusion  (Lorain, 1996)
                นำสารสกัดหยาบจากเชื้อราเอนโดไฟท์มาละลายด้วย  Dimethyl  sulfoxide (DMSO) ให้ได้ความเข็มข้น 100 mg/ml เก็บไว้เป็น stock solution ที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียส  แล้วทำการทดสอบฤทธิ์ต้านจุลินทรีย์

                การเตรียมเชื้อ         
                   เตรียม  inoculums   ด้วยการ  streak เชื้อแบคทีเรีย  S. aurues  ATCC29523,  MRSA SK1, E. coil ATCC25922  และ P. aeruginosa  ATCC27853 บนอาหาร NA  และ เชื้อยีสต์
C. albicans ATCC90028  และ C. neoformans ATCC90012   บนอาหาร SDA แล้วนำไป incubate ที่ 35 องศาเซลเซียสนาน 18-24 ชั่วโมง แต่เชื้อยีสต์ C. neoformans ATCC90012 incubate ที่อุณหภูมิห้อง 48 ชั่วโมงแล้วเขี่ยเชื้อ 3-5 single colonies  ลงในอาหาร NB สำหรับแบคทีเรียและ SDB สำหรับเชื้อยีสต์นำไป incubate ไว้ที่ 35 องศาเซลเซียส 3- 5 ชั่วโมง หลังจากนั้นนำมาปรับให้ได้ความขุ่น 0.5 McFarland standard สำหรับแบคทีเรีย  และ 2.0 McFarland standard สำหรับยีสต์ตามลำดับด้วย NSS  สำหรับเชื้อรา นำเชื้อ M. gypseum นำมาเพาะบนอาหาร  SDA ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 2-3 สัปดาห์ จากนั้นเตรียม spore suspension ให้ได้ความเข้มข้นของสปอร์ 1× 104-1 ×105 สปอร์/ml


การทดสอบฤทธิ์ต้านแบคทีเรีย
                    นำสารสกัดหยาบด้วย DMSO  ความเข็มข้น 100 mg/ml เป็น 1:10 ทำการเจือจางต่อจาก 1:10 ให้เป็น 1:25 ด้วย MHB จะได้ความเข้มข้นเป็น 400 µl/ml แล้วดูดสารสกัดหยาบใส่ sterile 96-well microtiter platesหลุมละ 50 µl โดยทำการทดลองสองซ้ำ  แล้วเตรียม noculums  ของเชื้อแบคทีเรีย ที่มีความขุ่น 0.5 MF โดยเจือจางด้วย  NSS จะได้ความเข้มข้นของสารละลายเชื้อประมาณ  1:200 (~ 5×105 cfu/ml) แล้วดูดใส่ sterile 96-well microtiter plates ที่มีสารสกัดหยาบอยู่ข้างต้น ใส่ในหลุมละ 50 µl แล้วนำไป incubated ที่ 35 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 15 ชั่วโมง เมื่อครบกำหนดเวลาจากนั้นหยด resazurin indicator (0.18%)  10 µl แล้ว incubated  2-3 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 35 องศาเซลเซียส 
โดยชุดควบคุมจะใช้ยาปฏิชีวนะที่มีความเข้มข้น 4 µg/ml สำหรับแบคทีเรีย S. aurues ATCC29523และ MRSA SK1 ใช้ยา vancomycin, E.coil ATCC25922 และ P.aeruginosa ATCC27853 ใช้ยา gentamycin  
     
                การทดสอบฤทธิ์ต้านเชื้อยีสต์
                    สำหรับยีสต์ ก็ทำเช่นเดียวกับ แบคทีเรีย แต่จะใช้อาหาร RPMI-1640 ทำการเจือจางต่อจาก 1:10 ให้เป็น 1:25 แล้วนำไป incubated ที่อุณหภูมิ 35 องศาเซลเซลเซียส เป็นเวลา  24   ชั่วโมง สำหรับ C. albicans และ incubated ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 48 ชั่วโมง สำหรับ C. neoformans  หลังจากนั้นหยด resazurin indicator (0.18%)  10 µl แล้ว incubated  5 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 35       องศาเซลเซียส  โดยชุดควบคุมทดสอบใช้ยาปฏิชีวนะ amphotericin B ที่มีความเข้มข้น 4 mg/ml

                การทดสอบฤทธิ์ต้านเชื้อรา
                     ทำเช่นเดียวกับแบคทีเรีย แต่จะใช้อาหาร RPMI-1640 ทำการ เจือจางต่อจาก 1:10 ให้เป็น 1:25 เช่นเดียวกัน แล้วนำไป incubated ที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซลเซียส เป็นเวลา 6 วันจากนั้นหยด resazurin indicateor (0.18%)  10 µl แล้ว incubated อีกหนึ่งวันที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียสโดยชุดควบคุมทดสอบใช้ยาปฏิชีวนะ Miconazole ที่มีความเข้มข้น 4 mg/ml

              การแปลผล
                เมื่อหยด resazurin indicator (0.18%)  10 µl แล้ว หลังจาก incubated ถ้าให้ผลเป็นสีฟ้าหรือสีม่วง แสดงว่าผลเป็นบวก คือสามารถยับยั้งได้ และถ้าให้ผลเป็นสีชมพู่ แสดงว่าให้ผลเป็นลบคือไม่สามารถยับยั้งได้ จากนั้นนำผลที่เป็นบวกจากการทดสอบ MIC ไปทดสอบ MBC และ MFC ต่อไป

การหาค่า MIC ของสารสกัดหยาบจากน้ำเลี้ยงเชื้อรา
                การเตรียมยาต้านจุลินทรีย์มาตรฐาน
                 สำหรับยา vancomycin, gentamicin  เตรียมให้ได้ความเข้มข้นเริ่มต้น 16 mg/ml  ส่วนยา amphotericin B  เตรียม 10 mg/ml หลังจากนั้นละลายยาโดยใช้น้ำกลั่นไร้เชื้อ แบ่งใส่หลอด   แล้วเก็บไว้เป็น stock solution  ที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียส

การทดสอบฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรีย  ยีสต์  และรา
               นำสารสกัดหยาบจากเชื้อราเอนโดไฟท์มาละลายด้วย DMSO ให้ได้ความเข็มข้น 100 mg/ml เก็บไว้เป็น stock solution ที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียสแล้วทำการเจือจางสารสกัดจาก strock solutionให้เป็น 1:39 ด้วยอาหารเหลว MHB และ RPMI สำหรับใช้ทดสอบกับเชื้อแบคทีเรียและยีสต์ตามลำดับ
วิธีการทดสอบหาค่า MIC
                     ดูดอาหารเหลว MHB และ RPMI-1640  ใส่ sterile 96-well microtiter plates หลุมละ 50 µl แล้วดูดสารกัดหยาบใส่ sterile 96-well microtiter plates ที่มีอาหารเหลวอยู่ หลุมละ 50 µl แล้วทำการเจือจางแบบ 2-fold dilution  เพื่อให้ได้ความเข้มข้นของสารสกัดหยาบอยู่ในช่วง       128-0.25 µg/ml แล้วดูดอาหารและสารสกัดที่ความเข้มข้นสุดท้ายทิ้ง 50 µl โดยทดสอบความเข้มข้นละ 2 ซ้ำ จากนั้นดูดเชื้อที่มีอัตราส่วน 1:200 ที่ต้องการทดสอบที่เตรียมไว้ใส่ sterile 96-well microtiter plates ที่มีอาหารเหลวและสารกัดหยาบ หลุมละ 50  µl เขย่า  incubate ที่อุณหภูมิ 35 องศาเซลเซียส 18-24 ชั่วโมงสำหรับเชื้อแบคทีเรีย ที่อุณหภูมิ 35 องศาเซลเซียส 24-48 ชั่วโมง สำหรับเชื้อยีสต์ และที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 72 ชั่วโมงสำหรับเชื้อรา
      
วิธีการตรวจสอบผลค่า MIC
1.  สำหรับเชื้อแบคทีเรียเมื่อ incubate ครบกำหนดแล้วหยด resazurin indicater (0.18%)  10 µl แล้ว incubated  3-5 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 35 องศาเซลเซียส  บันทึกผล
2.  สำหรับเชื้อยีสต์ก็ทำเช่นเดียวกับเชื้อแบคทีเรีย
3.  สำหรับเชื้อราเมื่อ incubate ครบกำหนดเวลาแล้วหยด resazurin indicator (0.18%) 10 µl แล้ว incubated ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 72 ชั่วโมง 
       
                การแปลผล MIC
      หลังจากหยด resazurin indicater (0.18%) 10 µl ดูผลและบันทึกค่าความเข้มข้นต่ำสุดของสารที่สามารถยับยั้งการเจริญของเชื้อได้

การหาค่า MBC  (Minimum Bactericidal Concentration) และ MFC (Minimum fungicidal Concentration)  ของสารสกัดหยาบจากน้ำเลี้ยงเชื้อรา
                หาค่า MBC (Minimum Bactericidal Concentration) และ MFC (Minimum fungicidal Concentration) โดยนำผลที่ระดับความเข้มข้นที่สามารถยับยั้งเชื้อได้ในการทดสอบ MIC มา streak บนอาหารแข็ง NA สำหรับเชื้อแบคทีเรียและ streak   บนอาหารแข็ง SDA   สำหรับเชื้อยีสต์ อ่านผลโดยเชื้อที่ถูกสารฆ่าได้จะแสดงผลลบคือ ไม่มีโคโลนีของเชื้อเกิดขึ้นบนจานเลี้ยงเชื้อ

11.  แผนการดำเนินการวิจัย


ขั้นตอนการดำเนินงาน
ระยะเวลา
ไตรมาส 1
(เม..-..)
ไตรมาส 2
(มิ..-..)
ไตรมาส 3
(ก..-..)
ไตรมาส 4
(ธ..-..)
1.              เสนอโครงการ



2.              เก็บตัวอย่างพืชป่าพรุควนเคร็ง



3.             ดำเนินการวิจัยการคัดเลือกราเอนโดไฟท์ที่มีฤทธิ์ยับยั้งจุลินทรีย์ก่อโรคจากป่าพรุควนเคร็ง



4.             สรุปผลและจัดทำรายงานฉบับสมบูรณ์





12.  งบประมาณ


สารเคมีและอาหารเลี้ยงเชื้อ
ราคา
1.             Saburaund  dextrose  agar
1,160
2.             Saburaund dextrose  broth
1,500
3.    Mueller  hinton  agar
1,116
4.    Mueller  hinton  broth
1,100
5.    Potato  dextrose  agar
1,160
6.    Potato  dextrose  broth
1,500
7.    Nutrient agar
1,150
8.    Nutrient  broth
1,050
9.    Dimethyl  sulfoxide
850
10.  Ethyl  acetate
1,149
11.  Hexanes
855
12.  Sodium sulfate  anhydrous
500
รวม
13,090


13.  เอกสารอ้างอิง

ขนิษฐา  พุดหอม, (มปป.)  สรุปย่องานวิจัยราเอนโดไฟท์ที่แยกได้จากพืชป่าชายเลน.

คงเดช สวาสดิ์พันธ์, งามผ่อง คงคาทิพย์ และคณะ, (มปป.) การสกัด และแยกสารออกฤทธิ์ยับยั้งเชื้อรา และเชื้อแบคทีเรียจาก พลูไทย.  มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์  กรุงเทพฯ.

ชัยวัฒน์  บุญมากาศ,  อัมพร  ศุภตระกูล,  และทวีรัตน์  วิจิตรสุนทรกุล,  (2550).  สารออกฤทธิ์ทางชีวภาพจากราเอนโดไฟท์ของพืชในวงศ์  Stemonaceae  ในการยับยั้งจุลินทรีย์ที่ก่อโรคในพืช.  วารสารวิทยาศาสตร์เกษตร.  กรุงเทพฯ.  ปีที่  38  ฉบับที่ 6 

นัยนา ต่างใจ และสุริยา  ฤธาทิพย์, (2550). ประสิทธิภาพการยับยั้งเชื้อจุลินทรีย์บางชนิดของสารสกัดจากหมากนวล. วารสารวิทยาศาสตร์เกษตร.  กรุงเทพฯ.  ปีที่  40  ฉบับที่ 3. 

ปิยะวดี   เจริญวัฒนา, (2550).  ประสิทธิภาพของสารสกัดพลูในการยับยั้งเชื้อรา  Aspergillus  flavus. วารสารวิทยาศาสตร์เกษตร  ปีที่  38  ฉบับที่  6.

พูนลาภ ป้อมเป็ง, นาตยา งามโรจนวณิชย์ และคณะ,  (มปป.)ฤทธิ์ต้านจุลินทรีย์ของราเอนโดไฟต์จากกรวยป่า เพกา และ กอมขม. คณะวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี.
มารุต  ตั้งชุลีพร,  รมิตา  เพียมขุนทด และภูริชญา  สมภาร,  (2551). ฤทธิ์ต้านจุลินทรีย์ของสารสกัดใบชะมวง  (Garcinia  cowa  Roxb.)  วารสารสาธารณสุขมหาวิทยาลัยบูรพา  ปีที่ 3 บับที่ 2.

ลินจง สุขลำภู , ปวลี คงศิริสัจธรรม และคณะ , (มปป.)  กิจกรรมต้านจุลินทรีย์ของสารสกัดหยาบจากเปลือกส้มโอพันธุ์ขาวใหญ่และทองดี. สาขาวิชาชีววิทยา คณะวิทยาศาสตร์ สถาบันเทคโนโลยีพระจอมเกล้าเจ้าคุณทหารลาดกระบัง กรุงเทพฯ.

ศรัญญา พรศักดา, มาระตรี เปลี่ยนศิริชัย  และคณะ,  (2553).  ผลของสารสกัดจากมะเขือพวงในการยับยั้งแบคทีเรียก่อโรค Escherichia coli, Staphylococcus aureus และ Salmonella typhimurium.     วาสารวิทยาศาสตร์เกษตร  ปีที่ 41 ฉบับที่ 3/1.

อาแว  มะแส,  สมบูรณ์  เจริญจิระตระกูล,  คันธรส  พวงแก้ว,  และปริญญา  บันฑิโต. 2546.  บทบาทชายหญิงต่อการพัฒนาอาชีพที่เชื่อมโยงกับการจัดการทรัพยากรธรรมชาติในพรุควนเคร็ง.  Wetland  International-Thailand  Office.  และกลุ่มพัฒนาชุมชนจังหวัดชายแดนภาคใต้  เอกสารตีพิมพ์ลำดับที่  18.

ไม่มีความคิดเห็น:

แสดงความคิดเห็น